Pengenalan Alat, Bekerja secara Aseptik, Sterilisasi dan Pembuatan Media

TINJAUAN PUSTAKA

1.      Pengenalan Alat

Pengenalan peralatan laboratorium sangat penting untuk dilakukan sebelum menggunakan laboratorium. Pengenalan peralatan laboratorium akan membantu peneliti untuk mengenali peralatan sehingga ia tahu prinsip-prinsip, cara kerja, dan bagaimana menggunakan peralatan laboratorium tersebut. Pengenalan alat juga diharapkan dapat meminimalkan terjadinya kesalahan dan kecelakaan saat menggunakan mengoperasikan peralatan laboratorium (Gunawan 2012).

Pengetahuan alat merupakan salah satu faktor yang penting untuk mendukung kegiatan praktikum. Siswa akan terampil dalam praktikum apabila mereka mempunyai pengetahuan mengenai alat-alat praktikum yang meliputi nama alat, fungsi alat, dan cara menggunakannya. Pengetahuan alat yang kurang akan mempengaruhi kelancaran saat praktikum. Sebagai contoh, selama praktikum siswa dilibatkan aktif dengan pemakaian alat dan bahan kimia. Siswa yang menguasai alat dengan baik akan lebih terampil dan teliti dalam praktikum sehingga siswa memperoleh hasil praktikum seperti yang diharapkan (Laila 2006).

Hal yang paling utama yang harus dipahami oleh praktikan sebelum melakukan praktikum adalah mengetahui terlebih dahulu nama-nama alat, fungsi, dan cara penggunaan alat-alat yang akan kita gunakan, agar praktikum yang akan dilakukan berjalan dengan baik.  Penggunaan alat ini dengan tepat penting untuk diketahui agar pekerjaan tersebut dapat berjalan dengan baik. Keadaan yang aman dalam suatu laboratorium dapat kita ciptakan apabila ada kemauan dari para pekerja, pengguna, maupun kelompok pekerja laboratorium untuk menjaga dan melindungi diri, diperlukan kesadaran bahwa kecelakaan yang terjadi dapat berakibat pada dirinya sendiri maupun orang lain disekitarnya (Setiawati 2002).

2.      Bekerja Secara Aseptik

Aseptik berarti 'tanpa mikro-organisme'. Teknik aseptik mengacu pada praktek yang digunakan untuk menghindari kontaminasi organisme patogen. Tujuan utama dari teknik aseptik adalah untuk melindungi pengguna dari kontaminasi oleh organisme patogen selama prosedur medis dan keperawatan dan untuk melindungi dari hal-hal yang berpotensi menular dari mikroorganisme tersebut. Hal ini dapat dicapai dengan memastikan bahwa hanya peralatan steril (Wilson 2006).

Bekerja secara aseptik yang dilakukan dapat mencegah kontaminasi mikroba selama prosedur invasif atau perawatan dalam integritas kulit. Dua jenis asepsis dapat dilakukan pada mikrobiologi klinis ialah asepsis medis dan bedah. Aseptik medis digunakan untuk menekan jumlah organisme dan mencegah penyebaran mereka dan terutama digunakan di daerah lingkungan dan beberapa daerah perawatan lainnya, misalnya rawat jalan klinik. Asepsisis Bedah proses yang ketat dan termasuk prosedur untuk menghilangkan mikro-organisme dari suatu daerah dan dipraktekkan oleh perawat dan petugas kesehatan lainnya (Ayliffe 2000).

Teknik aseptik harus digunakan selama prosedur invasif yang pertahanan alami tubuh, misalnya kulit atau selaput lendir. Asepsis harus selalu dilakukan pada kondisi aapun. Mempertahankan sterilitas bisa sulit tetapi penting untuk mencegah kontaminasi pada peralatan yang digunakan (Dawe 2011).

3.      Sterilisasi

Pemilihan desinfektan, konsentrasi, dan waktu paparan didasarkan pada risiko infeksi terkait dengan penggunaan peralatan dan faktor lainnya. Metode sterilisasi yang dibahas meliputi sterilisasi uap, etilen oksida (ETO), peroksida plasma gas hidrogen, dan asam perasetat cair. Ketika digunakan dengan benar, disinfeksi, dan proses sterilisasi dapat mengurangi risiko infeksi  dan kontaminasi. Hal ini akan menuntut peneliti untuk selalu memperhatikan kebersihan, pembersihan dan disinfeksi pada setiap prosedur yang ia lakukan (Rutala et al. 2008)

Risiko utama dari semua cara sterilisasi adalah pengenalan mikroba patogen yang dapat menyebabkan infeksi. Kesalahan melakukan disinfeksi atau sterilisasi peralatan yang akan digunakan kembali membawa risiko yang terkait dengan kontaminasi. Sterilisasi harus selalu melalui disinfeksi yang baik dan benar. Pengguna harus mempertimbangkan keuntungan dan kerugian dari metode khusus ketika memilih proses disinfeksi atau sterilisasi (Rutala 2013).

Pedoman dari Komite Penasehat Mikrobiologi (MAC) telah dilakukan untuk dekontaminasi, disinfeksi dan sterilisasi peralatan. Proses dekontaminasi yang dipilih harus sesuai dengan risiko infeksi yang berkaitan dengan penggunaan peralatan yang dimaksudkan. Sterilisasi merupakan prasyarat penting untuk desinfeksi dan sterilisasi dan dapat dilakukan secara manual atau mekanis. Disinfeksi adalah perusakan patogen ke tingkat yang dapat diterima dan dicapai dengan menggunakan pasteurisasi uap, autoklaf atau bahan kimia. Sterilisasi dilakukan untuk membunuh semua mikroba dan dilakukan dengan menggunakan uap, udara panas kering, etilen oksida, formaldehid atau iradiasi (Lewis 2004).

4.      Pembuatan Media

Dua jenis bahan yang digunakan untuk medium, yaitu nutrient agar (NA) untuk membuat medium untuk bakteri dan PDA (Potato Dextrose Agar) untuk membuat media untuk jamur. Prosedur kerja untuk membuatnya, pertama kentang dikupas dan ditimbang 100g, cincang halus dan direbus untuk mash dalam air suling. Dekstrosa diukur (12.5g) dan ditempatkan dalam gelas ukur. Agar 1L diukur (12.5g) dan ditambahkan ke gelas ukur (dengan dekstrosa). Kentang tumbuk diaduk dan disaring ke dalam silinder. Akuades ditambahkan untuk membuat isi 500mL kemudian dituangkan ke dalam tabung reaksi labu kerucut. Labu ini kemudian diautoklaf pada 121 ⁰C selama 24 jam. Kisaran pH antara 6,5-7,0 (Jagesar 2008).

NA digunakan untuk budidaya bakteri dan untuk penghitungan organisme dalam air, limbah, kotoran dan bahan lainnya. NA terdiri dari pepton, ekstrak daging sapi dan agar. NA memberikan nutrisi yang diperlukan untuk replikasi sejumlah besar mikroorganisme.  Daging sapi ekstrak mengandung zat yang larut dalam air termasuk karbohidrat, vitamin, senyawa nitrogen organik dan garam. Peptone adalah sumber utama nitrogen organik, terutama asam amino dan rantai peptida (Downes dan Ito 2001). 

Medium tumbuh yang digunakan untuk jamur adalah Potato Dextrose Agar (PDA). Medium tumbuh dibuat dengan campuran bahan-bahan yaitu kentang yang telah dikupas 200 g, gula pasir 20 g, tepung agar 16 g, aquades 1000 ml. Pembuatan medium dilakukan dengan cara berikut. Kentang diiris-iris setebal 1 cm, direbus sampai diperoleh air rebusan yang kekuning-kuningan yaitu ketika kentang mulai lunak. Air rebusan kentang disaring dengan menggunakan kain saring. Filtrat hasil saringan air rebusan kentang tersebut ditambahkan dengan gula pasir dan tepung agar kemudian semua bahan dipanaskan dan di aduk sampai larut. Setelah semua bahan-bahan larut, medium tumbuh tersebut disterilkan di autoclave selama ± 15 menit pada suhu 21⁰C dengan tekanan 1,5 atm. Saat medium tumbuh dalam keadaan hangat diberi Streptomycin sulfate yang berfungsi sebagai antibiotik penghambat bakteri kontaminan. Kemudian larutan medium tumbuh dituang dalam cawan steril, selanjutnya dibiarkan pada laminator air flow sampai memadat (Arif et al. 2007).

PEMBAHASAN

Pengenalan alat- alat yang digunakan di laboratorium mikrobiologi sangat penting dilakukan. Hal ini supaya mahasiswa sebagai peneliti nantinya bisa bekerja dengan dengan baik sesuai prosedur sehingga hasil penelitiannya juga bisa berhasil. Pengenalan alat selain untuk memperkenalkan nama dan fungsi, juga dilakukan untuk mengenalkan cara kerja dan prinsip kerja alat tersebut.

Berdasarkan hasil pengamatan, pengenalan alat dalam praktikum dibagi menjadi dua yaitu pegenalan alat kecil dan pengenalan alat besar. Pengenalan alat kecil meliputi beberapa alat antara lain stirrer, jarum ose, gelas ukur, pipet, pinset, kaca preparat, deglass, dry glasky, hand colony counter, chip, mortar, erlenmeyer, gelas beaker, petridis, sprayer, tabung reaksi, mikropipet, saringan mikoriza dan bunsen. Sedangkan pengenalan alat besar meliputi mikroskop stereo dan binokuler, oven, incubator, hot plate, centrifuge, vortex dan LAF (laminar air flow).

Bekerja di laboratorium mikrobiologi perlu dilakukan prosedur bekerja secara aseptik. Aseptik berarti tanpa adanya mikroorganisme. Aseptik juga berhubungan dengan steril. Bekerja secara aseptik ini perlu dilakukan untuk menjaga kesterilan pengguna, alat dan bahan-bahan yang digunakan dari kontaminasi karena mikrobia berukuran sangat kecil, tidak kasat mata, mudah tersebar dan hidup dimana saja. Bekerja secara aseptik ini merupakan bagian dari safety procedure (prosedur keamanan dalam bekerja di laboratorium mikrobiologi) (Suhardi et al. 2008).

Bekerja secara aseptik dilakukan dengan cara mensterilkan pengguna, alat dan bahan baku terlebih dahulu sebelum memulai praktikum. Pengguna (peneliti) melakukan prsedur aseptik dengan menggunakan masker dan sarung tangan yang sebelumnya pada sarun tangan tersebut disemprotkan alkohol 70% untuk sterilisasi tangan dari kontaminasi mikroorganisme. Alat dan bahan juga dilakukan prosedur aseptik dengan mensterilkannya terlebih dahulu sebelum digunakan dengan beberapa cara tergantung dari asal bahan tersebut misalnya dengan penyemprotan alkohol, penyinaran dengan UV, dengan panas kering atau prosedur steril lain.

Menurut Hastuti (2008), sterilisasi berhubungan pula dengan bekerja secara aseptik. Sterilisasi merupakan proses untuk mematikan semua mikroorganisme yang terdapat pada atau didalam suatu benda. Sterilisasi bisa dilakukan dengan dengan tiga cara yaitu dengan cara mekanik, fisik dan kimiawi.

Sterilisasi secara mekanik. Perbedaan penggunaan cara sterilisasi ini disebabkan karena perbedaan bahan  penyusun alat dan karakteristik bahan, yakni ada yang terbuat dari kaca, liquid (mengandung air) ataupun ada yang peka terhadap panas.

Sterilisasi secara fisik dilakukan dengan cara filtrasi atau penyaringan menggunakan saringan berpori sangat kecil (0,22 mikron sampai 0,45 mikron) sehingga  mikrobia tertahan pada saringan tersebut. Sterilisasi secara mekanik ini dilakukan pada bahan yang peka panas, misalnya larutan enzim dan antibiotik. Kedua larutan tersebut, sangat peka panas, dan akan terdenaturasi pada keadaan panas dengan suhu tertentu sehingga untuk menghindari kerusakan maka dilakukanlah sterilisasi dengan filtrasi ini. 

Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan atau dengan penyinaran dengan UV. Pemanasan dilakukan dengan beberapa teknik antara lain membakar langsung pada api, dengan panas kering, dengan uap air panas serta dengan uap air panas bertekanan. Pemanasan secara langsung dengan cara (pemijaran) dilakukan dengan cara membakar alat tersebut pada api secara langsung. Biasanya digunakan pada alat yang terbuat dari bahan logam. Misalnya saja pada sterilisasi jarum inokulum, pinset, dan batang L. Selanjutnya, sterilisasi dengan panas kering yaitu sterilisasi yang dilakukan dengan oven dengan suhu kira-kira 60-180⁰C. Sterlilisasi  panas kering ini cocok dilakukan untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya Erlenmeyer, pipet, dan tabung reaksi. Sterilisasi dengan pemanasan yang lain ialah dengan uap air panas dan uap air panas bertekanan. Konsep uap air panas ini mirip dengan mengukus. Biasanya dilakukan pada bahan yang mengandung air sehingga menghindari terjadinya dehidrasi. Serilisasi dengan uap air panas bertekanan dilakukan dengan autoklaf selama beberapa jam (Irianto 2010).

Sterilisasi secara kimiawi dilakukan dengan menyemprotkan disinfektan seperti alcohol 70%. Fungsi alcohol ini untuk mematikan miroorganisme yang ada pada alat tersut sehingga alat menjadi steril saat digunakan. Sterilisasi secara kimiawi dengan alcohol 70% dilakukan pula untuk mensterilkan meja kerja dan tangan peneliti juga.

Media adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran zat makanan yang berfungsi sebagai tempat tumbuh mikroba. Suatu media harus memenuhi beberapa syarat yang mampu menunjang pertumbuhan mikrobia. Syarat tersebut adalah mengandung nutrisi yang diperlukan mikrobia untuk tumbuh, memiliki tekanan osmosis, pH dan tegangan permukaan harus sesuai, tidak mengandung zat penghambat dan steril (Singleton dan Sainsbury 2006).

Media untuk pertumbuhan mikroba ada beberapa macam, antara lain berdasarkan susunan kimia, konsistensi, fungsi dan tujuannya. Medium berdasarkan susunan kimianya yaitu medium organik, medium anorganik, medium sintetik dan medium non sintetik. Medium organik yaitu medium yang tersusun dari bahan-bahan organik. Medium anorganik, yaitu medium yang tersusun dari bahan-bahan anorganik. Medium sintetik, yaitu medium yang sususan kimiawinya dapat diketahui dengan pasti. Medium non-sintetik, yaitu medium yang susunan kimiawinya dapat diketahui dengan pasti.

Macam medium berdasarkan konsistensinya adalah cair, semi padat dan padat. Media cair (liquid medium) adalah medium berbentuk cair yang dapat digunakan untuk tujuan menumbuhkan atau membiakan mikroba, penelaah fermentasi, uji-uji lain. Contohnya: Nutrient Broth (NB), Lactose Broth (LB) dan kaldu sapi. Media semi padat (semi solid medium), biasanya digunakan untuk uji mortalitas (pergerakan) mikroorganisme dan kemampuan fermentasi. Contohnya: Agar dengan konsentrasi rendah 0,5%. Media padat (solid medium) adalah medium yang berbentuk padat yang dapat digunakan untuk menumbuhkan mikroba dipermukaan sehingga membentuk koloni yang dapat dilihat, dihitung dan diisolasi. Contohnya:  Nutrient Agar (NA), Potato Dextrose Agar (PDA).

Macam medium berdasarkan fungsi dan tujuan antara lain adalah media selektif, media diferensial, media penguji, media untuk penghitungan jumlah dan media diperkaya. Media selektif adalah media yang bersifat selektif untuk mencegah pertumbuhan mikroba lain sehingga dapat mengisolasi mikroba tertentu. Contohnya : Endo Agar, EMB (Eosin Metilena Biru) Agar, SSA (Salmonella Shygella Agar), VRB (Violet Red Bile Agar). Media diferensial, untuk mengidentifikasi mikroba berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni. Media penguji adalah media dengan susunan tertentu digunakan untuk pengujian-pengujian vitamin, asam amino, antibiotik dan lain-lain. Media untuk perhitungan jumlah adalah media spesifik yang digunakan untuk menghitung jumlah mikroba. Contohnya : Potato Dextrosa Agar (PDA) untuk fungi, Natrium Agar (NA) untuk bakteri Media diperkaya adalah medium yang ditambah zat-zat tertentu (serum, darah, ekstrak tumbuhan dan lain-lain), digunakan untuk menumbuhkan mikroba heterotrof.

Pembuatan medium pada pengamatan ini adalah dengan pembuatan medium NA dan PDA. Medium merupakan suatu bahan yang terdiri atas campuran zat makanan (nutrient) yang berfungsi sebagai tempat tumbuh mikrobia. Medium juga dapat digunakan pula sebagai tempat isolasi, memperbanyak, pengujian sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikrobia. Pembuatan medium harus memenuhi beberapa hal, sehingga medium yang dibuat bisa digunakan sebagaimana fungsinya. Syarat-syarat tersebut ialah mengandung nutrisi yang diperlukan mikrobia, memiliki tekanan osmosis, pH dan tegangan permukaan yang sesuai, tidak mengandung inhibitor dan steril. Medium dapat dibedakan berdasarkan susunan kimianya, konsistensinya, dan tujuannya. Pembuatan medium berdasarkan tujuannya misalnya NA yang digunakan untuk bakteria, dan PDA yang digunakan untuk jamur.